原产于中国PH1593 | 植物线粒体DNA提取试剂盒 Plant Mitochondrial DNA Extraction Kit

看了又看

产品名称 : PH1593 | 植物线粒体DNA提取试剂盒 Plant Mitochondrial DNA Extraction Kit
产品品牌 : 飞净 PHYGENE

 

线粒体 DNA 提取的关键是尽可能的去掉核 DNA。本试剂盒利用差速离心得到比较纯净的线粒体,再利用 DNA 酶消化和裂解缓冲系统等多步骤去掉核 DNA,最后得到纯净的线粒体 DNA。可用于 PCR 等对纯度要求较高的实验。

本试剂盒用于从植物叶片中分离出完整而纯化的线粒体。适合于田间采摘或者实验室培养的植物叶片中线粒体 DNA 的提取制备。


试剂存储
本试剂盒整体保存于 2-8℃一年,Dnase I -20℃保存。使用前,在 DNase I 中加入 600ul(50T)或者 1200ul(100T)的DNA 酶反应液,分装后-20℃保存三个月,如果超过三个月,活性可能会降低,请自行订购 DNASE I。线粒体裂解液使用前常温保存,如有沉淀可 37℃水浴溶解,不影响使用。


使用参考

准备工作: :在 Dnase I 中加入 600ul(50T)或者 1100ul(100T)的 DNA 酶反应液,适当分装后-20℃保存。线粒体裂解液保存于常温,如有沉淀 37℃水浴溶解,离心机温度下降到 4℃(2-8℃),如无低温离心机,也可以常温离心,并将离心时间为 10min 的改为 5min,但最后所得 DNA 品质及产量可能会有一定影响。

1.  样本采集前处理:无论田间自然生长还是实验室组织培养,采摘前须避光生长 24-48 小时,以减少叶片组织中糖类及叶绿体含量。取适量植物细胞裂解液,加入 0.5% β-巯基乙醇,如 10ml 植物细胞裂解液加入 50ulβ-巯基乙醇,混匀,形成植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,此溶液可 2-8 度保存一个月。


2. 叶片用蒸馏水清洗 2-3 次,滤纸吸干,有条件请用液氮研磨叶片 1-2 克,研磨完后,取 800mg 左右研磨的叶片粉,加入1.5ml 预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀。如果无条件(无液氮),请预冷研钵,取洗过的叶片 1000 mg,用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入 1.5ml 预冷的植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,冰上研磨至看不见明显组织块;

3. 将研磨物放置合适的离心管,4℃,1000× g 离心 5 min;

4. 将上清转移到一新的离心管中,在沉淀中加入 0.5ml 植物细胞裂解液/β-巯基乙醇溶液,混匀,再次 4℃,1000× g 离心5 min,取上清;合并两次上清,将上清 4℃ 1000× g 再次离心 5 min。

5.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 16,000 × g 离心 10 min。离心后的上清含胞浆成分,可从中提取胞浆蛋白。将上清转移到新离心管,线粒体沉淀在管底。

6. 在线粒体沉淀中加入 0.5 mL 线粒体清洗液重悬线粒体沉淀,4℃,1000× g 离心 5 min;

7.取上清,加入一新的离心管中,4℃, 16,000 × g 离心 10 min。弃上清,高纯度的线粒体沉淀在管底;

8. 加入 100ul DNA 酶反应液重悬线粒体,吹打均匀后,再加入 10ul DNASE I 溶液(见准备工作),混匀,37℃水浴 10min。此步为消化线粒体表面吸付的核 DNA。4℃, 12,000 × g 离心 5 min。尽可能的弃上清,再加入 200ul TE 重悬线粒体沉淀,4℃,12,000 × g 离心 5 min,洗去残留的 DNA 酶。

9.得到的沉淀,用 200ul TE 缓冲液重悬线粒体沉淀,加入 10ul RNase A。加入 200ul 线粒体裂解液,轻轻混匀(不可吹打),放置 1-2min,再加入 150ul 蛋白沉淀液,迅速混匀。4℃, 12,000 × g 离心 5 min。此步骤可进一步去除核 DNA。

10.取上清,加入一新的离心管中(如用于酶切分析,可加入此步:选用等体积的酚氯仿异戊醇 25:24:1 抽提一次,再用氯仿抽提一次,或者直接用氯仿抽提两次,一般来说,此步可去掉一些微量蛋白及糖类,但会造成线粒体 DNA 的损失,因而用于 PCR 时可省,并不影响后续实验),加入 0.6 倍体积的异丙醇(如无异丙醇,可加入 2.5 倍体积的乙醇沉淀 DNA,如离心管太满可分两管)及 5-10ul 核酸核酸助沉剂,混匀,-20℃沉淀半小时左右(此步可省),4℃, 12,000 × g 离心 10 min。

11. 弃上清,再加入 1ml 70%乙醇清洗,4℃, 12,000 × g 离心 5min。重复用 70%乙醇洗一次。

12. 弃上清,再次离心 1min 吸弃上清,不要碰到管底,开盖凉干约 5-10min。

13.加入 20-30ul TE 缓冲液,轻弹管底,37℃水浴 5 分钟,线粒体 DNA 溶解。

14. 进行 DNA 电泳检测及-20℃保存,进行下步的实验。(由于部分植物线粒体本身 DNA 含量很低,可以富集多个样本合并浓缩或进行 PCR 检测)


注意事项
1. 以离心力 g 计算正确的离心速度,不同的离心机可据此精确计算离心速度。
2. 进行 Western Blot 和 2D-胶电泳,可直接在第 7 步的沉淀中加入上样缓冲液裂解线粒体。
3. β-巯基乙醇有毒,请注意通风及防护


附:一般低温度心机都有离心力显示,如果没有,可以用以下公式简单的换算。
转速与离心力换算
G=1.11×(10 -5 )×R×[rpm] 2
G 为离心力,一般以 g(重力加速度)的倍数来表示;
[rpm]2 即:转速的平方; R 为半径,单位为厘米。

温馨提示:1.本产品仅供科研使用。请勿用于医药、临床诊断或治疗,食品及化妆品等用途。请勿存放于普通住宅区。2.为了您的安全和健康,请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。3.实验结果可由多种因素影响,相关处理只限于产品本身,不涉及其他赔偿。

对自己使用过的商品进行评价,它将成为大家购买参考依据。
评论隐私保护:1.匿名评论;2.注册用户评论(加密处理)
用户可放心发表使用后的心得感受我要评价
全部评价(0)
暂时还没有任何用户评论
    ×
  • 匿名用户
  • captcha
商品已成功加入购物车
<<继续购物 去结算