PH1928 | 嘌呤霉素溶液(Puromycin,10mg/mL)(Puromycin,1mg/mL)

产品简介：
Puromycin是来源于Streptomyces alboniger的一种氨基核苷类抗生素,中文名为嘌呤霉素,常用于筛选能够表达pac基因（puror）的细胞。pac基因表达嘌呤霉素N-乙酰转移酶(Puromycin N-acetyl-tranferase),如果该基因表达,就会对嘌呤霉素产生抗性,这一特性目前普遍应用于筛选表达pac基因的哺乳动物稳定细胞株。目前,很多商业化的慢病毒载体都携带pac基因(一般在质粒图谱上标记为puror),可以利用嘌呤霉素的筛选,得到特定基因稳定表达的细胞株。嘌呤霉素也可以用来筛选表达pac基因的大肠杆菌菌株、酵母菌株等。Puromycin不仅能用于稳定细胞株的筛选,也用于稳定细胞株的维持。Puromycin的作用特点是快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的不表达pac基因的细胞。


本产品浓度为10mg/ml,已过滤除菌,可以直接用于细胞培养。

使用说明：


一、推荐工作浓度：

推荐的作用于哺乳动物细胞的嘌呤霉素浓度一般为1-10μg/ml,但最佳工作浓度需要通过剂量反应曲线来确定。 


二、嘌呤霉素剂量反应曲线的确定(以shRNA转染或者慢病毒感染为例）：

嘌呤霉素的有效筛选浓度与细胞类型、生长状态、细胞密度、细胞代谢及细胞所处细胞周期等因素相关。为了筛选到稳定表达的shRNA或感染病毒的细胞株,确定杀死未转染/感染细胞的最低浓度嘌呤霉素非常重要。对于初次使用的细胞,一般需要通过实验来确定适合自身实验体系的剂量反应曲线(dose-response curve or kill curve)。


1、第一天：24孔板中以5~8×104cells/孔的密度接种细胞,接种够量的孔以便进行后续的剂量梯度实验。细胞培养箱内培养过夜。

2、第二天： 在培养过夜后的细胞中更换新鲜配制的筛选培养基,该筛选培养基为含不同浓度嘌呤霉素的新鲜培养基(如0、1、2.5、5、7.5、10μg/ml等),更换培养基后在细胞培养箱中继续培养。

3、第三天后：由于嘌呤霉素可以快速作用于细胞,一般2天内可以杀死99%的未表达pac基因的细胞,所以在加嘌呤霉素后的1-2天就可以进行观察细胞存活率,从而确定有效杀死正常细胞的药物最低浓度。如果细胞耐药性比较强,需要每日观察,一般4-10天内即可确定嘌呤霉素的最低浓度。


三、哺乳动物稳定表达细胞株的筛选：


转染含有pac基因的质粒或者感染含有该基因的病毒后,即可筛选稳定表达株。

1、细胞转染或感染48小时后,将细胞置于含有适当浓度嘌呤霉素的新鲜培养基中培养,此为处理组。

注意：当细胞处于分裂活跃期时,抗生素作用最明显。细胞过于密集,抗生素产生的效力会明显下降,所以细胞的密度最好不超过25%。建议同时做一个正常细胞的对照组。转染或感染48小时后,如果细胞过密也可以消化后重新接种细胞,培养过夜后即可进行嘌呤霉素筛选。

2、每隔2-3天,更换含有嘌呤霉素的培养基。

3、筛选7天后,对照组正常细胞应该100%死亡,处理组中存活的细胞为表达pac基因的细胞。然后根据实验目的进行多克隆或单克隆细胞的筛选。

注意：每日进行细胞生长状态的观察。嘌呤霉素的筛选至少需要24小时,有效浓度嘌呤霉素的筛选周期一般在2-10天。

4、待细胞可以稳定生长后,嘌呤霉素的浓度可以减半用于后续的培养。在得到稳定表达细胞株后,一般建议嘌呤霉素也须持续加入,并2-3天更换含有嘌呤霉素的新鲜培养液。


注意事项：

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

保存条件: 冰袋运输， -20℃保存,一年有效,尽量避免反复冻融。

Puromycin is an amino nucleoside antibiotic from Streptomyces alboniger, named purinomycin in Chinese, which is often used to screen cells that express pac gene (puror). The pac gene expresses Puromycin N-acetyl-tranferase (Puromycin n-acetyl-tranferase), which, if expressed, induces resistance to purinomycin. This trait is now commonly used to screen stable mammalian cell lines expressing pac. Currently, many commercial lentiviral vectors carry the pac gene (usually labeled as puror on the plasmid map), and cell lines with stable expression of specific genes can be obtained by screening with purinomycin. Purinomycin can also be used to screen Escherichia coli strains and yeast strains that express pac gene. Puromycin can be used not only for screening stable cell lines, but also for maintenance of stable cell lines. Puromycin is characterized by its rapid action on cells, killing 99% of cells that do not express the pac gene within two days.