PH2005 | 组织自发荧光淬灭剂 Autofluorescence quencher

产品简介

免疫荧光技术利用荧光分子标记的抗体对与之结合的抗原进行定位，实现对蛋白质、聚糖蛋白、小生物分子及非生物分子等进行亚细胞可视化观察。在此过程中，组织中的自发荧光往往会严重干扰观察。自发荧光是在免疫荧光检测过程中产生的与目的信号无关的背景荧光信号的统称，其产生的原因主要来自于组织本身的组分，例如黄素、卟啉、植物叶绿素、胶原蛋白、弹性蛋白、红细胞、脂褐素等都会产生较强的自发荧光，显著影响免疫荧光实验的信噪比。此外组织固定中使用的福尔马林、多聚甲醛等物质也会产生大量的自发荧光。

本产品可有效减少组织自发荧光，提高免疫荧光检测的信噪比。能显著降低脂褐素引起的自发荧光。

储存与运输：常温避光保存，有效期12个月。

组织自发荧光淬灭剂A液
组织自发荧光淬灭剂B液

使用方法

1. 免疫标记前的自发荧光淬灭：组织切片在经过抗原修复以后，用组化笔画圈圈出组织，然后滴加组织自发荧光淬灭剂A液覆盖组织室温孵育30 min，纯水洗5 min。

2. 组织切片进行常规的封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAPI复染细胞核等免疫荧光检测步骤。

3. 免疫标记后的自发荧光淬灭：滴加组织自发荧光淬灭剂B液覆盖组织室温避光孵育5 min，流水冲洗3 min。

4. 封片：玻片置于PBS中晃动洗涤（可置于脱色摇床上）3次，每次5 min。切片稍甩干后封片，镜检。

注意事项

1. 不同样本其自发荧光原理不同，使用组织自发荧光淬灭剂的效果可能会有差异。组织自发光淬灭液B液可以在DAPI染色之前使用。

2. 理论上讲，针对自发荧光的淬灭剂也会一定程度降低抗体的荧光强度。但该淬灭剂对自发荧光的淬灭程度远远超出抗体荧光强度的降低，在二者之间有较好的平衡。

3. 组织自发荧光淬灭剂A液如果是和双氧水连着用，会对DAPI着色有影响，如果做TSA实验，不建议加组织自发荧光淬灭剂A液。

4. 加入组织自发荧光淬灭剂B液后组织会染成深蓝色，但是不会影响荧光拍照。

5. 切片经B液孵育完以后可以用水或者PBS洗涤，但不能用含吐温的溶液洗涤，否则B液被过度洗去影响背景荧光淬灭效果。

6. 组织自发荧光淬灭剂B液每次用完后务必将瓶盖拧紧，防止溶剂挥发。

7. 若B液孵育后组织上有杂质冲不干净，可用70%乙醇将B液稀释一倍后使用。

8. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。

----------------------------------------------------------------

组织自发荧光是指生物组织中的某些天然成分在受到特定波长的光激发后会发出荧光的现象，这通常是它们本身固有的特性。一种观点是认为这种内源性分子结构中包含多环碳氢化合物，它能够吸收一定波长的光，使电子发生跃迁，从高能级回到低能级时以发出光子的形式释放能量，从而观察到发射光，即类似于荧光蛋白的发光原理。

组织自发荧光的发射波长可以覆盖到蓝光、绿光甚至红光，也就是说大部分自发荧光的激发波长在350-500nm左右，发射波长在385-550nm左右，仅少数会达到600-700nm的发射波长。可见自发荧光的光谱范围基本覆盖到了我们常用的蓝、绿、红色荧光，其中主要的自发荧光物质包括但不限于以下几种：

  （1）NAD(P)H：一种存在于所有活细胞的代谢辅助因子和电子载体，参与能量代谢过程，但只有还原形式的NAD(P)H能被激发出荧光；

  （2）黄素类物质：例如FAD存在于线粒体中，也是能量代谢和电子传递链中的重要代谢物，它与NAD(P)H相反，FAD只有氧化形式可以产生荧光；

  （3）胶原蛋白和弹性蛋白：这两种蛋白在细胞外基质中含量非常丰富，组织分布也很广，包括皮肤、内脏、血管、肌腱、毛发和指甲等等，这些可能是难以避免的自发荧光，检测前有必要了解此类情况；

  （4）脂褐素：随着细胞和生物体衰老而逐渐积累的一种物质，能够产生自发荧光；

  （5）色氨酸：作为蛋白质的组成成分，其自发荧光信号与蛋白质结构和结合状态有关。

在植物样本中，自发荧光主要由以下成分引起：

1.叶绿素：在植物细胞中，叶绿素的自发荧光是最为常见的。

2.木质素：植物细胞壁中的木质素也会产生显著的自发荧光。

3.其它化合物：如阿魏酸、角质素、木栓质、孢粉质及黄酮类化合物等，均可能导致植物样本中的自发荧光。



 （1）选择近红外荧光蛋白：即使绿色、红色荧光蛋白的荧光信号都比较强，但易受组织深度、自发荧光的干扰，往往效果检测效果不佳。如果一定要用荧光蛋白的话，可以选择发射波长更长的近红外荧光蛋白（例如iRFP，激发波长690nm，发射波长713nm），可以很大程度上减少组织深度和自发荧光的干扰。

   （2）选择LUC（荧光素酶）：LUC的发光需要与底物发生化学反应才能产生，属于化学发光现象，无需使用激发光激发，因此可以有效避免活体成像时自发荧光的干扰。

   （3）动物剃毛：毛发中富含弹性蛋白等物质，易产生自发荧光，因此观察前可将对应的部位进行剃毛处理，避免毛发自发光的影响。

   （4）饲料荧光：涉及消化道方面的成像，至少提前一星期使用无荧光饲料喂养动物，避免食物中可能含有的荧光物质的影响。

   （5）选择成像灵敏度高的系统：选择灵敏度高的成像系统也可以一定程度上提高检测效果。

2、关于组织切片观察

       对于组织切片观察病毒感染效率，通常是做冰冻切片或石蜡切片。前者不会破坏荧光蛋白的构象，则可以直接观察荧光蛋白的荧光；而后者在固定过程会影响荧光蛋白的构象，导致无法被正常激发出荧光，此时可采用免疫荧光的方式观察组织中的荧光蛋白，以判断感染效率。

（1）冰冻切片：冰冻切片若是出现自发荧光干扰，目前似乎还没有比较好的解决方法。实验前考虑到这点或者所检测的组织有报道可能存在明显的自发荧光时，可以做预实验先观察目标组织的自发荧光情况，再决定正式实验的取材方式和检测方法。

（2）石蜡切片：即使是可以通过免疫荧光观察感染效率，但实际上石蜡切片的自发荧光也很强。除了一些内源性物质外，常用的醛类固定液包括甲醛、戊二醛和福尔马林等也是造成自发荧光的重要因素，它们可与醛反应的蛋白形成共价交联等结构，进而产生大量的自发荧光。针对这些原因，可以参考以下方法减少自发荧光带来的背景干扰：

   ① 固定前处理：组织固定前先用PBS灌洗组织，去除红细胞，其中含有大量的卟啉，也是重要的背景荧光来源之一；

   ② 针对醛类固定液的影响：使用非醛类固定液，例如冰乙醇，可以有效降低因醛类反应所产生的自发荧光；

   ③ 针对组织内源性物质的影响：苏丹黑和硼氢化钠是两种自发荧光清除试剂，两种有各自的优缺点，也有联合使用的情况，具体大家可以参考试剂的说明书。

      1）苏丹黑：这是一种非荧光重氮染料，可与组织非特异性结合，通过吸收入射光来降低组织的自发荧光。对于由脂褐素引起的自发荧光非常有效，但对于醛类和红细胞等产生的自发荧光效果不佳，甚至在远红外激发光下其自身也会有自发荧光。另外，苏丹黑也能用于中性的脂质冰冻切片，降低其自发荧光，但同时可能会有抑制荧光蛋白荧光的风险。

      2）硼氢化钠：硼氢化钠是一种还原剂，可以还原石蜡组织中因醛类固定产生的C=C键或C=N键，以减少自发荧光；但硼氢化钠在中性pH中不稳定，也属于易燃易爆物，有一定的危险性，且效果重现性低。它与苏丹黑联合使用，理论上可以从两方面减少自发荧光的干扰。具体效果最好提前试验一下。

   ④ 有充足时间可以做预实验先检验实际组织的自发荧光情况，依次做实验设计的调整。