PH0234 | 血液RNA提取试剂盒 Blood RNA Kit

Blood RNA Kit采用胍盐与硅胶柱结合法，能够快速有效地从血液中提取高质量的RNA。血液加入红细胞裂解液裂解红细胞，收集白细胞，在RNA抑制酶环境下裂解白细胞，使RNA释放出来后可以稳定的吸附在离心柱上，经过四步快速洗涤去除各种盐分和杂质，最后将RNA溶解于DEPC水中从离心柱上洗脱下来。

试剂盒组成

储存和稳定性

TRNsol 4℃放置，其他试剂室温保存。试剂盒从购买之日起1年内有效。

预防RNase 污染，应注意以下几方面：

Ø 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

Ø 使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

Ø RNA 在Buffer PR中时不会被RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在1500C烘烤4小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

Ø 配制溶液应使用RNase-free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度0.1%( v/v)，混匀后放置过夜，高压灭菌）。

溶液的稀释准备：

Ÿ使用前Buffer WB和RNA Wash Buffer要加入无水乙醇，加入的体积参照产品标签的提示。

ŸBuffer R1（10X）需按1:9稀释。

操作步骤

1.红细胞裂解液稀释：根据处理的血液样品的体积吸取适量的Buffer RL(10X) ，用灭菌水按1:9稀释。（例如处理单个200μl的血液样品，吸取140μl Buffer RL，加入1260μl 灭菌水）。

2.在15mL离心管中加入小于1.5mL全血加入5体积的buffer RL工作液（buffer RL经过稀释）

3.冰上放置 10-15 分钟，其间颠倒混匀两次。

注意：在放置过程中，血液会从雾状变成透亮的溶液。透亮的溶液就表明了红细胞已裂解。如必要的话，可延长至 20 分钟。

4.4℃，2100rpm(~400×g离心10分钟，小心完全吸弃上清液。

5. 立即涡旋20秒，打散白细胞沉淀。向沉淀中加入1ml TRNsol,剧烈涡旋重悬细胞，转移裂解液至1.5ml离心管中，室温放置2-5min。

6. 加入0.2ml氯仿。盖上离心管盖子，剧烈地振荡15sec,在冰上孵育5min。室温下，12,000xg下离心10min。
此时混合物分成三层：底层为苯酚氯仿相层，中间层，和上层水相层。RNA完全存在于水相中。

7. 转移不多于80%上层水相至新的离心管中，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀。

8. 将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒。
若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱，请分两次转入GBC吸附柱中，12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，弃掉收集管中的废液。

9.向吸附柱中加入500ul Buffer WB(第一次使用前务必添加乙醇）高心30秒，弃废液。

10.向吸附柱 中加入600ul RNA Wash Buffer,12,000rpm(~13,400×g)离心30秒，倒掉废液，吸附柱放入收集管中。
注意：RNA Wash Buffer使用前请先检查是否已加入无水乙醇）

11. 向吸附柱 中加入600ul RNA Wash Buffer,12,000 rpm(-13,400xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中。

12. 12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉废液，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的实验

13. 将吸附柱转入一个新的离心管中，加30-100ul RNase-free Water,室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟。
注意：洗脱缓冲液体积不应少于30ul,体积过小影响回收效率。且RNA应保存在-70℃，以防降解。如果想提高RNA得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。