PH0231 | 细菌RNA提取试剂盒 Bacterial RNA Kit

产品简介

Bacterial RNA Kit可从培养的动物细胞或者细菌中快速提取总RNA，可同时处理大量不同样品。30-40 min内即可完成反应，提取的总RNA纯度较高，基本没有DNA和蛋白质污染，可用于RT-PCR、Real Time RT-PCR、芯片分析、Northern Blot、Dot Blot、PolyA 筛选、体外翻译、 RNase 保护分析和分子克隆等多种下游实验。

*酶中含有50%甘油，吸取时，移液器不能伸的太入，以免吸头外壁带走酶

存储和稳定性：冰袋运输，TRNsol 4℃保存，溶菌酶（Lysozyme）-20℃存储，其余常温保存。

预防RNase 污染，应注意以下几方面：

1）经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。

2）使用无RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。

3）提取后的RNA在继续处理过程中应使用不含RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在1500℃烘烤4 小时，塑料器皿可在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。

4）配制溶液应使用RNase-free ddH2O。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入DEPC 至终浓度0.1%( v/v)，混匀后放置过夜，高压灭菌）。

浓缩的Buffer WB需用无水乙醇按如下稀释：

*50T规格的Buffer WB使用前r加入14 ml ；100T规格的Buffer WB加入28ml 无水乙醇；

浓缩的Wash Buffer II需用无水乙醇按如下稀释：

*50T规格的RNA Wash Buffer使用前r加入52 ml ；100T规格的RNA Wash Buffer加入104 ml 无水乙醇；

操作步骤

1． 12,000 rpm(~13,400×g)离心2 min收集菌体（收集菌体的最大量不超过1×10⁹），仔细去除所有培养基上清。

注：如果培养基上清去除不完全，将对第二步中的细胞壁消化过程产生抑制。

2．用100 μl Buffer BTL 彻底重悬菌体，加入20μl Lysozyme，涡旋混匀。37℃孵育5- 10min。

3. 加入1mL TRNsol，剧烈的振荡30秒，室温放置5-10min。

4.  加入0.2mL Buffer LF。盖上离心管盖子，剧烈的振荡15秒，在冰上孵育5min。室温下，12000×g 下离心10min。

此时混合物分为三层：底层为苯酚氯仿相层，中间层和上层为水相层。RNA完全存在于水相层中。

5. 转移不多于80%上层水相至新的离心管中，缓慢加入0.7倍体积的无水乙醇，混匀。

6. 将得到的溶液和沉淀一起转入RNA Columns吸附柱中，12,000 rpm(~13,400×g)离心30秒。

若一次不能将全部溶液和混合物加入吸附柱中，请分两次转入，12,000 rpm(~13,400×g)离心30秒，弃掉收集管中的废液。

7. 向吸附柱中加入500μl Buffer WB，12,000 rpm(~13,400×g)离心30秒左右，弃废液。

注意：Buffer WB使用前须按要求用无水乙醇稀释，如果放入冰箱中，使用前需恢复至室温。

8. 向吸附柱中加入600μl RNA Wash Buffer，12,000 rpm(~13,400×g)离心30秒左右，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

注意：RNA Wash Buffer使用前请先检查是否已加入无水乙醇。

9．重复步骤8。

10．12,000 rpm(~13,400×g)离心1 min，倒掉废液。以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：此步骤目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液的残留，可能会影响后续的实验。

11.  将吸附柱转入一个新的RNase-Free离心管中，加30-100 μl DEPC-water，室温放置2 min，12,000 rpm(~13,400×g) 离心1 min，得到RNA溶液。

注意：洗脱缓冲液体积不应少于30 μl，体积过小影响回收效率。RNA溶液请于-70℃保存，以防降解。如果想提高RNA取得率，可重复上步操作一次，合并两次得到的溶液。