PH0751 | 抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）检测试剂盒（PNP微板法）

产品简介

抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistnt Acid Phosphatase Colorimetric Assay Kit)检测原理是利用Para-nitrophenyl phosphate(pNPP)为一种常用的磷酸酶显色底物，在酸性条件下，可在酸性磷酸酶的作用下生成p-nitrophenol。在碱性条件下p-nitrophenol呈黄色，产物黄色越深，说明酸性磷酸酶活性越高，反之则酶活性越低，通过分光光度比色法(酶标仪)测定吸光度，据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测，检测得到的酸性磷酸酶的活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶的活性。该试剂盒可用于检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

试剂组分：

自备材料：

1、PBS 或生理盐水

2、离心管

3、水浴锅或恒温箱

4、96 孔板、酶标仪

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品：

①血浆、血清和尿液样品：血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定，尿液通常也可以直接用于测定，-20℃冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。

②细胞或组织样品：取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要可用 PBS 或生理盐水进行适当匀浆，一般细胞数量在 10 6 以上，组织应在 100mg 以上，3000~4000g 离心取上清，-20℃冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。

③植物样品：取适量的植物组织加入少量 PBS 或生理盐水，充分捣碎或研磨，静置 30min，用纱布或滤纸过滤，4000g 离心 20min，留取上清液并测量体积，-20℃冻存，用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。

④高活性样品：如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酶，可以使用 ACP Assay buffer、PBS 或生理盐水稀释后再行检测。

2、配制显色工作液： 取出 1 支 pNPP，恢复至室温后溶解于 2.5ml ACP Assay buffer，混匀，冰上预冷备用，新配制的显色工作液应在 6h 内用完。

3、配制系列标准品：取出 p -nitrophenol(10mM)恢复至室温，按 p -nitrophenol(10mM)：ACP Assay buffer=1：19 的比例混合，使浓度达到 0.5mM，-20℃冻存备用。按下表继续稀释：

4、TRAP 加样：按按照下表设置空白孔、标准孔、空白孔，溶液应按照顺序依次加入，并注意避免产生气泡。如果样品中的 TRAP 活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置平行孔。

6、TRAP 测定：轻轻混匀，37℃孵育 25～30min，每孔加入 160μl Stopping Solution 终止反应。以空白调零，酶标仪测定 405nm 处标准管、测定管的吸光度。

计算：

计算： 酸性磷酸酶活性单位的定义：在 pH4.8 37℃条件下，每分钟水解 para-nitrophenyl phosphate 显色底物产生 1 微摩尔 p -nitrophenol 所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。根据酶活性定义，计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。系列标准品(1~6 号)浓度(即 p -nitrophenol 含量)50、100、200、300、400、500μ

M 为横坐标，以对应的标准孔吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，根据测定孔的吸光度在标准曲线上查得待测样品的含量。

注意事项：

1、待测样品中不能含有磷酸酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、如果待测样品体积较少，可减少样品加样量，以 ACP Assay buffer 补至 30μl。

3、如果无法检测 405nm，亦可检测 400～415nm 范围内吸光度。

4、建议每次测定时都最好作标准曲线，以使标准更准确，另外标准品避免反复冻融。

5、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用小体积的比色杯。

6、所测样品的含量高于标准曲线的上限，应用 ACP Assay buffer 稀释样品后重新测定。

7、配制 1 支显色工作液后应当日用完，因此请注意适当多准备一些样品一起检测。

8、p -nitrophenol 溶液对人体有害，反应终止液有腐蚀性，请小心操作。

9、如果希望进行酶活性的绝对定量，进行酶反应时应精确计时，此时推荐采用孵育 30min或更长时间，以减小操作过程中的时间误差。

10、待测样品中抗酒石酸酸性磷酸酶活性较低时，可适当延长孵育时间至 30min。