PH1420 | PhyZol™ Total RNA Extraction Reagent / PhyZol™ 总RNA提取试剂

该款试剂用于细胞或组织的总RNA提取试剂。采用与某进口品牌完全相似的原理和方法，颜色、抽提的方法和步骤亦与它相同。本制品含酚和异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞或组织并且灭活核酸酶，保持RNA的完整性。加入氯仿并离心后，溶液形成上清层为水相(无色)、中间层、下层为有机相(红色)。上清层用异丙醇沉淀回收总RNA，中间层用乙醇沉淀回收DNA，下层用异异醇沉淀回收蛋白。

Phygene的总RNA提取试剂适用于从各种组织或细胞中快速分离总RNA，既可用于小量样品(50～100 mg组织、5×10⁶细胞)，也可用于大量样品(>1g组织/>10⁷细胞)。提取的总RNA质量高，可用于Northern blot、Dot blot、polyA筛选、体外翻译、RNase保护分析和分子克隆。

具有以下特点：

①适用范围广；②操作简单，整个过程1小时内完成；③纯度高；④污染少。

自备材料：

1、试剂：无水乙醇、氯F、异丙醇、DEPC处理水等。

2、耗材： RNase广泛存在于人的皮肤上和体液及环境中，RNase是导致RNA降解的最主要物质，非常稳定。操作时应佩戴一次性口罩、手套、帽子。塑料制品、玻璃和金属物品、实验仪器等应清除RNase，移液器吸头、EP管等制品的RNase free处理尤为重要。

3、仪器：低温高速离心机、低温冰箱。

使用说明

操作步骤(仅供参考)：

1、样品准备

①贴壁细胞：

接裂解：直接在培养瓶/皿中加入该试剂裂解细胞，每10cm²面积加1ml 提取试剂，用移液器吹打混匀。

胰蛋白酶消化：用无菌PBS洗涤细胞后，加入含有0.05～0.25%胰蛋白酶的PBS处理细胞，当细胞脱离容器壁后，加入含有血清的培养基终止反应，将细胞溶液转移至无RNase的离心管中，5000～6000g离心5 min，收集细胞沉淀，去除上清。收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则裂解不完全，降低RNA收获率。

②悬浮细胞：无需清洗细胞，直接5000～6000 g离心5 min，收集细胞。每5×10⁶～10⁷动物、植物和酵母细胞或每10⁷细菌细胞加入1ml 提取试剂。

③组织：取新鲜动物或者植物组织或者-70℃冻存组织，50～100mg组织在液氮中充分研磨或者加入1ml 提取试剂研磨或者用匀浆器匀浆处理。样品体积一般不超过该试剂体积的10%。研磨要迅速，以1min为佳。

④血液：取0.5～1 ml新鲜或冻存的血液，12000g离心5 min，去除血浆，加入1ml RNA提取试剂，充分振荡混匀。

2、核酸分离：充分振荡混匀(可以置于低温/超低温冰箱冻存5～10 min后，充分振荡，反复1～3次)，将裂解样品或匀浆液室温放置5～10 min，使核蛋白与核酸完全分离。

3、样品分层：加入0.2 ml 氯F/1ml RNA提取试剂，剧烈振荡15 s，室温放置2～3 min。置于4℃离心机，12000 g离心10～15 min。上层为水相，中间层和下层为有机相，RNA在上层水相。

4、沉淀RNA：吸取上层水相(约500μl)转移至无RNase的离心管中(不要吸取任何中间层物质,否则会有染色体DNA污染)，加入等体积异丙醇混匀，室温放置15～20 min。12000 g 4℃离心10 min，离心后管侧或管底形成胶状沉淀，弃上清。

5、洗涤RNA：加入1ml DEPC水配制的75%乙醇/1ml RNA提取试剂洗涤沉淀，室温放置5～10 min，7500g 4℃离心5 min，弃上清。室温干燥5～10 min，不宜过分干燥，否则RNA难以溶解。

6、溶解RNA：加入30～50ul RNase-free ddH2O充分溶解RNA，-70℃长期保存或直接用于后续试验。对于肝、胰腺、肾等组织中RNase含量高的样品，沉淀时用100%去离子甲酰胺溶解。

分析与定量：

1、测定样品在260 nm和280 nm的吸收值确定RNA的质量。按1OD=40pg RNA计算RNA的产率。OD260/280在1.8～2.2视为抽提RNA纯度较好。浓度在4μg/ml以上的样品适于用分光光度计测定。

2、进行甲醛变性琼脂糖电泳，确定RNA的完整性和污染情况。

3、核酸分析仪测定RNA的质量和纯度。

注意事项

1、样品保存：加入提取液混匀后，样品可在-70℃放置1～2月；RNA样品可以在70%酒精中-70℃保存2～4周：如果需要长期保存，应置于超低温冰箱中保存。

2、本试剂属于腐蚀性物质，污染皮肤或眼睛后，立即用清水或生理盐水冲洗，必要时寻求医生的帮助。

3、本试剂可常温运输，建议保存2-8℃保存。

4、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。